俗话说，堡垒最容易从内部被攻破。这句话应用在镰仓幕府的衰亡上是再合适不过。1333年，镰仓幕府的御家人足利尊氏在各地反幕府的动乱中迅速崛起，很快成为讨幕中坚，最终与各地豪强一起迫使北条氏一族全部自杀，镰仓幕府就此完结。当然，这时候意得志满的足利尊氏不会想到，近250年以后，自己的子孙也会被武将逼死，成为历史的烟云。
1331年6月，在足利尊氏与地方豪族推翻镰仓幕府的统治后，因多次谋划倒幕行动而被北条氏流放到隐歧岛的后醍醐天皇返回京都，废除了由镰仓幕府扶持的光严天皇，再次登基，重新掌控了朝政。1334年，后醍醐天皇改年号为“建武”，并实施了一系列的新政，史称“建武中兴”。
后醍醐天皇实施的新政，最重要的部分就是撤销威胁天皇权力的关白、摄政等职务，一切大权由天皇本人总揽，对皇室和大贵族的利益极力保护，却对在推翻镰仓幕府中立下战功的武士的利益不闻不问，这种做法引起了各地武士的极度不满。而与此同时，恢复天皇之位没多久的后醍醐天皇为了满足一己私欲，无视长年战乱给百姓带来的苦难，肆意增加税收，征发劳役，在京都大兴土木，出现了“兵革之后，世局未稳，国费民苦”的乱象。后醍醐天皇的倒行逆施激起了农民的不满，由此，后醍醐天皇逐渐失去了武士和农民对他的支持。
此时的足利尊氏虽然获得了天皇的赐名，但是并没有获得他梦寐以求的“征夷大将军”的名号，反倒受到后醍醐天皇的种种限制，这让足利尊氏非常失望。
1335年7月，即建武二年，北条氏旁支北条时行在信浓举兵，并很快攻陷镰仓，史称“中先代之乱”。8月初，足利尊氏未等天皇下诏，率领500名骑兵，离开京都，与其弟足利直义会合，大破北条时行，夺回了镰仓。占据镰仓后，足利尊氏并没有返回京都，而是自称征夷大将军，向后醍醐天皇竖起了反旗，这让后醍醐天皇十分恼火。11月19日，天皇任命尊良亲王、新田义贞为正副征讨将军，讨伐足利尊氏。足利尊氏与其弟率军大败天皇的军队，其间，天皇方面也曾多次击败足利尊氏。1336年5月，足利尊氏进入京都，拥立光严天皇的同母胞弟丰仁亲王即位，是为光明天皇。“建武中兴”由此宣告结束。
以胜利者姿态进入京都的足利尊氏很快软禁了后醍醐天皇，同年11月，后醍醐天皇被迫将象征天皇权威的三神器交给光明天皇，自己则被尊为上皇。但是后醍醐天皇并不甘心被人摆布，12月21日晚，他装扮成女性贵族，乘车逃离京都，在吉野建立了新的政权，并宣布交给光明天皇的三神器为伪造品。自此形成了与京都皇室对立的局面，日本历史上的南北朝由此形成。
北朝的实际控制者足利尊氏在被光明天皇正式任命为“征夷大将军”后重启武家政治，在京都建立了足利幕府。幕府建立不久，为了整顿武家制度，改革朝政，足利尊氏颁布了武家法典《建武式目》。《建武式目》提出“居安思危”的观点，认为首要之责是“早休万人愁”，“政在安民”。在这一思想的指导下，《建武式目》提出要禁止奢侈，力行节俭，不得受贿行贿；选用贤能之人担任地方官，并要求豪强不得兼并私宅，以减少破产流浪者；委任效忠足利氏的有功、有才干的将领为各地守护。
1339年8月16日，53岁的后醍醐天皇因病去世。相传他临死前，一手握着《法华经》，一手抚剑，还立下遗诏：“纵领玉骨已埋南山，魂魄亦当常望北阙。”因此，后醍醐天皇的陵墓也与一般的朝南座北的传统葬式不一样，而是朝北坐南埋葬。后醍醐天皇死后没多久，追随他的几个南朝著名武将也相继战死，南朝似乎“气数已尽”，但是由于足利尊氏与其弟足利直义的内杠，南朝又残喘了50多年。
足利尊氏在起兵讨伐镰仓幕府之初，足利直义就一直辅佐足利尊氏，足利尊氏也视足利直义为左膀右臂，对他极为器重。足利幕府建立后，足利尊氏的家臣高师直担任重要职位，深得尊氏信任，备受恩宠，然后职权越高，骄奢越重，手下部将很是不满，足利直义对此也深为愤恨，决心除掉高师直。
1349年，足利直义与高师直的斗争发展到了白热化阶段，高师直要求足利尊氏革除足利直义的一切职务。足利尊氏答应了高师直的要求，撤掉了其弟全部职务。此后，高师直更为骄恣，而足利尊氏与足利直义之间的关系也因此日趋紧张。
1350年，足利尊氏与足利直义兵戎相见，足利直义投奔南朝，并于次年大败足利尊氏统领的北朝军队。尊氏派人求和，足利直义杀死高师直，随后足利尊氏与足利直义携手言和。第二年，足利尊氏与其子一同归顺了南朝。但是兄弟俩的和睦局面并没有维系多久，不久，足利尊氏又与足利直义产生了冲突，1352年2月，足利尊氏毒死了自己的弟弟。足利直义虽死，但他养子足利直冬率领着斯波高经、桃井直常、石堂义房、山名时氏等旧足利直义派依然与足利尊氏作战，先后数次占领过京都。
1358年4月30日，足利尊氏病故，时年54岁，埋在京都的衣笠山下的等侍寺内。足利尊氏死后，其子足利义诠继任将军，在执事斯波义将的辅佐下，足利义诠稳固了幕府统治，并逐步压制住了南朝势力。
1368年，年仅10岁的足利义满继任第三代幕府将军，由管领细川赖之任辅佐。足利义满成年亲政后，显示出卓越的统治与领导能力，先后平定了土岐赖康、山名氏清等地方守护的叛乱，幕府统治得以进一步巩固。同时，经过几次大的征伐，南朝的势力彻底衰退。1392年，足利义满对南朝提出统一的呼吁，并顺利实现南北朝合体，成功地结束长达60年的分割状态。由此，足利义满在全国范围确立起幕府将军的绝对统治权，成为室町幕府最盛期的缔造者。